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FPIA (Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay)

→ Kompetitiver Test
→ die Fluoreszenzpolarisation Intensität wird gemessen

Probe, Vorbehandlungsreagenz und Verdünnungs-/Spülpuffer werden zusammengegeben und auf eine Reaktionstemperatur gebracht. Die FPIA-Optik (Wolfram-Halogen-Lampe) nimmt eine erste Messung als Leerwert für den Assay (Ansatz) vor.

→ Kompetitiver Test

Antikörper, Tracer, Verdünnungs-/Spülpuffer und Probe werden zum Reaktionsgemisch gegeben und inkubiert. Der Analyt der Probe konkurriert mit dem Analyt-Tracer um die freien Bindungsstellen der Antikörper.


→ Ist eine geringe Konzentration des Analyten vorhanden, so binden mehr die Analyt-Tracer an die Antikörper
→Ist eine hohe Konzentration des Analyten vorhanden, so bindet der Analyt an die
freien Bindungsstellen der Antikörper.

→ die Fluoreszenzpolarisation Intensität wird gemessen

Die FPIA-Optik erfasst und misst die Änderung der Intensität des polarisierten Lichtes bei 485nm. Diese Änderung ist umgekehrt proportional Konzentration des Analyten in der Probe.

→ Enthält die Probe eine hohe Konzentration des Analyten, sind diese an die Antikörper gebunden, jedoch bleiben viele ungebundene Analyt-Tracer übrig. Bei Anregung durch polarisiertes vertikales Licht, drehen sich diese kleinen fluoreszierenden Moleküle schnell und emittieren Licht in vielen unterschiedlichen Ebenen. Das Ergebnis ist eine Intensitätsabnahme des polarisierten Lichtes.
(Wenig gebundene Tracer schnelle Drehung wenig Fluoreszenz viele Analyte in der Probe)

→ Enthält die Probe nur wenig oder gar keinen Analyten, bindet sich der Analyt-Tracer an die Antikörper, wodurch nur wenige ungebundene Analyt-Tracer-Moleküle übrig bleiben. Diese grossen Moleküle drehen sich langsamer und emittieren so das polarisierte Licht in derselben Ebene. Das Ergebnis ist eine Intensitätszunahme des polarisierten Lichtes.
(Viele gebundene Tracer langsame Drehung viel Fluoreszenz wenig Analyt in der Probe)
Flammenphotometer:
Prinzip:
Die Flammenphotometrie wird für die quantitative Bestimmung von Elementen der Alkali- (z.B. Li, Na, K) und Erdalkali-(z.B.Ca, Ba) Gruppe angewendet. Die Proben werden als verdünnte, wässrige Lösung mittels eines Zerstäubers in eine Propan/Luft-bzw. Acetylen/Luft-Flamme geleitet. Durch die Flamme werden die Metallionen zuerst verdampft und atomisiert. Die Valenzelektronen werden thermisch in energetisch angeregte Zustände überführt, die bei der Rückkehr in den Grundzustand Licht spezifischer Wellenlängen emittieren (Emission). Das emittiere Licht wird durch ein optisches System abgefangen und seine Intensität gemessen. Die Intensität der emittierten Strahlung ist bei geringen Analytkonzentrationen linear proportional zur Konzentration
des Elements. Dieses Phänomen dient als Basis für quantitative Bestimmungen. Jedes Element strahlt charakteristische Resonanzlinien als Emissionsspektrum aus. Die Methode besitzt deshalb ein hohes
Maß an Selektivität. Die Sensitivität der Methode ist abhängig von der Temperatur der Flamme.
.
Schema eines Flammenphotometers
In dem Gefäß P befindet sich die zu messende Probe. Sie wird über das Ansaugrohr A in den Zerstäuber Z gebracht und von diesem in die Flamme F geleitet. In der Flamme werden die Atome angeregt und strahlen Licht aus. Die Flamme verfärbt sich. Mit dem Monochromator wählt man genau das Licht, das man messen will. Beispiel Kalium: Kalium wird in der Flamme violett aufleuchten, viele andere Atome strahlen aber auch. Man stellt dem Monochromator auf die Wellenlänge von Kalium ein. Der Monochromator M lässt dann nur das vom Kalium stammende, violette Licht durch. Das am Detektor D gemessene Licht entspricht damit der Kaliumkonzentration in der Probe.
Ionensensitive Elektroden (ISE):

Mit dem ISE lassen sich Natrium, Kalium, Chlorid und Lithium (Im KSW →Flammenphotometer) bestimmt. Die Messung der Ionenselektive Elektrode beruht auf dem Prinzip der ionenselektive Durchflusselektrode.

Die Messung erfolgt an Festkörperelektroden. Dort baut sich ähnlich wie bei der pH-Elektrode auf beiden Seiten der Membran ein Diffusionspotenzial auf, das gemessen wird. Die chemische Struktur der Membran ähnelt häufig einem Ionenaustauscher und entscheidet über die Spezifität der Bestimmung. Bei modernen Analysenstystemen sind die Messelektroden und eine Referenzelektrode zu einem Chip zusammengefasst.

Ablauf:

In den ISE-Mischturm wird die Probe mittels Transferarm hinein pipettiert. Mit Hilfe von Luftdüsen wird dort Luft hineingeblasen um die Probe homogen zu mischen. Zusätzlich werden noch für z.B die Kalibration oder die Reinigung, ISE-Lösungen ( Solution 1,2,3 Activator, etc.) in den -Mischturm pipettiert. Mit Hilfe einer peristaltische Pumpe wird die Probe zum Messkanal transportiert. Durch einen Sensor im Messkanal wird die Flüssigkeit genau positioniert. Dann folgt die ISE Reference Electrolyte durch die Referenzelektrode in die Messkammer und somit wird ein Stromkreis zwischen Referenzelektrode und ionenselektive Elektroden geschlossen. Die Messung kann erfolgen. Nach der Messung wird die Probe aus dem Messkanal mit Systemwasser rausgewaschen und es folgt eine 1 Punkt-Kalibration (1-Punkt-Kalibration mit ISE Calibrator Direct und ISE Calibrator indirect/Urine) . Vor der nächsten Messung wird der Messkanal nochmals gereinigt (Reinigungslösungen ISE Etcher →Natriumelektrode oder ISE Deproteinizer)
Für die 2 Punkt-Kalibration, die jeweils nach 4 Stunden durchführt wird, werden ISE Solution 1 und 2, die sich im ISE Rack befinden, verwendet. Die ISE Solution 3 wird für die 3 Punkt-Kalibration von Lithium verwendet (KSWFlammenfotometer)

Membranen:

-Für die Natriummessung benutzt man heute eine ionenselektive Kunstoffmembran als Elektrode.
Sie enthält organische Ionophore (synthetische Moleküle, die als Ionenaustauscher wirken).
-Bei der Kaliummessung verwendet man eine ionenselektive Kunstoffmembran, die Valinomycin enthält. Da das Antibiotikum Valinomycin Kaliumionen binden kann. Die Silberchloridelektrode wird bei der Chloridmessung eingesetzt.

-Als Referenzelektrode dient eine unpolarisierbare Ag/AgCl-Elektrode,
Kinetische Bestimmung:
Für die Messung der Enyzymaktivität ist es notwendig, dass die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit erfasst wird. Es müssen Bedingungen herrschen, unter denen das Enzym mit Substrat und Coenzym gesättigt, der pH-Wert optimal und die Temperatur konstant ist.
Bei den kinetischen Enzymbestimmungen wird nicht die Enzymkonzentration gemessen, sondern die Enzymaktivität. Die Enzymaktivität entspricht der Geschwindigkeit, mit der die katalysierte Reaktion abläuft. Man kann entweder das Substrat oder das Produkt gemessen werden: die Enzymaktivität kann gleichermassen über die Geschwindigkeit des „Verbrauchs" des Substrates oder über die Geschwindigkeit des „Entstehen" des Produktes pro Zeiteinheit bestimmt werden.
Fotometrisch wird die Extnktion der Substratabnahme oder die Extinktion der Produktzunahme in genau definierten Zeitabschnitten bestimmt. Anschliessend wird die Differenz der einzelnen Extinktionsmessungen ausgerechnet. Während den einzelnen Messungen, muss das Enzym immer gleich viel Substrat katalysiert haben. Die Differnez von einem Extinktionspunkt zum nächsten muss also immer konstant sein. Diese Differenz nennt man ∆E/Min (Delta Extinktion pro Minute). Aus den mehreren ausgerechneten ∆E/Min-Resultaten wird der Mittelwert berechnet, welche mit einem entsprechenden Faktor multipliziert. Die Enzymeinheit Unit (U) ist diejenige Enzymmenge, die1μmol/L Substrat pro Minute unter definierten Standardbedingungen umsetzt.

Indikatorreaktionen
Die hohe Spezifität der Enzyme beim Umsetzten von Substraten wird zur Enzymbestimmung benutz. Das Problem vieler Enzymbestimmung liegt darin, dass die Substratumsetzung nicht direkt am Fotometer gemessen werden kann, weil sich das Reaktionsprodukt und Substrat nicht photometrisch unterscheiden lässt. Dafür werden sogenannte Indikatorreaktionen verwendet. Man verwendet z.B NAD+/ NADH.
Bei einer Wellenlänge von 340nm weist NAD+ kein Absorptionsmaximum auf, NADH dagegen schon. Da viele Reaktionen NAD+ als Cofaktor verwenden, kann durch die Messung der NADH-Konzentration indirekt die Menge des umgesetzten Substrats und damit die Enzym-Aktivität gemessen werden.


Oxidation: Edukt + NADH Produkt + NAD+ = Extiniktionsabnahme
Reduktion: Edukt +NAD+ Produkt + NADH = Extinktionszunahme
TRACE (Time Resolved Amplified Cryptate Emission)-Technologie:

Der Kryptor basiert auf der Trace-Technologie. Dabei wird ein emittiertes Signal eines Immunkomplexs zeitverzörgert gemessen.
Der Immunkomplex besteht aus dem gesuchten Antigen und zwei verschiedenen Antikörpern. Der erste Antikörper ist ein spezifischer monoklonaler mit Eurpoium-Kryptat konjugierter Antikörper, er fungiert als Donator (Energierspender). Der zweite Antikörper ist ein polyklonaler Antikörper der mit XL665-Protein konjugiert ist und fungiert als Akzeptor (Energieaufnehmer). Durch die Anregung mit Hilfe eines Stickstofflasers bei 337nm emittiert der Donator (Kryptat) ein langlebiges Fluoreszenzsignal im Mili-Sekunden-Bereich bei 620nm → siehe Abbildung a)
während der Akzeptor (XL 665) ein kurzlebiges Signal im Nanosekunden-Bereich bei 665nm erzeugt. → siehe Abbildung b)
Bei der Messung wird das gesuchte Antigen mit den beiden Antikörpern inkubiert, dabei bildet sich der Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex (Sandwich). Dadurch, dass ein Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex entsteht, kommt es zu einer räumlichen Nähe zwischen dem Donator und dem Akzeptor (d.h. der monoklonale, mit Eurpoium-Kryptat konjugierte Antikörper und der polyklonale mit XL665-Protein konjugierte Antikörper sind nahe beieinander) und zu einer Überlappung der Emissionsspektren der beiden Antikörper. Durch diese Faktoren kann es zum strahlungslosen Energietransfer kommen. Dabei wird das Fluoreszenzsignal des Donators verstärkt und die Lebensdauer des Akzeptorssignals verlängert. Das Donatorsignal und das Akzeptorsignal werden bei 665 nm gemessen. Das Akzeptorsignal kann aufgrund der Aufnahme der Energie des Donators in Mikrosekunden, anstatt in Nanosekunden gemessen werden. Das Signal ist proportional zur Analytkonzentration der Patientenprobe. → siehe Abbildung c)

Donator= In Mili-Sekunden
Akzeptor= In nano-Sekunden